专家论坛｜刘慧/鲁凤民/郭巨涛：乙型肝炎病毒核心蛋白变构调节剂的作用机理及临床研发和应用前景

HBV感染是我国病毒性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌的主要病因之一。HBV在感染肝细胞的有效复制是维持病毒持续感染和致病的必需环节。作为构成病毒核衣壳的结构蛋白，核心蛋白(Cp)在HBV复制周期的多个环节发挥支持和调控功能。本文将系统阐述Cp在HBV复制过程中的功能和机理，及在研的靶向HBV Cp装配的抗HBV新药分类、作用机制、临床研发现状及对乙型肝炎功能性治愈的潜在价值，以期为该类新药的研发和临床试验提供指导性意见。

1HBV Cp在病毒复制周期的多个环节发挥重要功能

完整的有感染性的HBV为直径42 nm的球形颗粒。外层为脂质囊膜，有3种囊膜蛋白(大、中、小表面抗原蛋白)镶嵌其中。囊膜内为直径约32 nm的正二十面体核衣壳。核衣壳内包装有3.2 kb的部分双链松弛环状DNA(rcDNA)[1]。HBV仅感染人肝细胞，这主要是因为肝细胞表面具有HBV的特异性受体Na+-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)[2]。HBV病毒颗粒与肝细胞表面的NTCP结合，通过内吞途径进入细胞。随后病毒囊膜与内吞体膜融合将核衣壳释放入细胞质中。核衣壳依次被转运至核孔复合体并在此解聚，将rcDNA释放入细胞核，并被修复产生共价闭合环状DNA (cccDNA)[3]。进入细胞核内的cccDNA与核小体结合并经进一步修饰形成微小染色体, 转录产生5种病毒信使RNA(mRNA)并翻译产生以下7种病毒蛋白：3.5 kb pre-C RNA，其翻译产生precore蛋白，该蛋白经后续切割加工最终成熟为HBeAg而被分泌至细胞外；含两个开放阅读框架的3.5 kb pregenomic RNA (pgRNA)，为典型的双顺反子转录本，通过其内部起始密码子的差异使用分别翻译产生Cp或病毒DNA聚合酶(pol)；2.4 kb RNA可翻译产生大表面抗原蛋白(large HBsAg)；2.1 kb RNA根据内部起始密码子的差异使用翻译产生中表面抗原蛋白(middle HBsAg)和小表面抗原蛋白(small HBsAg)；0.7 kb RNA翻译产生病毒X蛋白(HBx)[1]。

Cp蛋白由183个氨基酸残基组成，通常以同源二聚体形式存在。120个Cp二聚体可自发装配形成正20面体核衣壳[4]。作为病毒核衣壳的结构蛋白，Cp参与病毒复制的多个环节。第一，在HBV初始感染肝细胞过程中，Cp与微管转运蛋白及importin-α/β相互识别介导核衣壳被转运至核孔复合体。核孔蛋白与Cp相互作用诱导核衣壳解聚，并将病毒基因组rcDNA释放入核形成cccDNA[5]；第二，pgRNA和由其翻译产生的病毒DNA聚合酶复合物核衣壳化，从而为病毒DNA复制提供了相对隔离的反应场所以阻止细胞固有免疫对新合成病毒DNA的模式识别，Cp本身也在病毒DNA的逆转录复制过程中发挥着重要的调控作用。在此过程中，宿主蛋白磷酸酶Ⅰ催化Cp羧基端结构域去磷酸化以调节Cp与pgRNA的相互作用，并与pgRNA-pol复合物一起被包装入核衣壳[6]。在核衣壳内，pgRNA首先被逆转录产生负链DNA，并以此为模板进一步复制合成rcDNA；第三，在HBV感染的肝细胞中，除包装有pgRNA及处于复制不同阶段病毒DNA的核衣壳之外，绝大多数衣壳为不含病毒核酸的空衣壳。有别于核衣壳的装配，在空衣壳装配过程中并未发生Cp羧基端结构域去磷酸化。因此，与包装有病毒RNA或DNA的核衣壳不同，空衣壳是由高度磷酸化的Cp组成[7]；第四，含有rcDNA的核衣壳和空衣壳都可以通过Cp与病毒囊膜蛋白相互识别以启动病毒颗粒的装配和分泌[8]。最近的研究[9]发现，当成熟的rcDNA形成时，正二十面体核衣壳通过改变Cp蛋白的构象而与镶嵌在多囊泡体膜上的病毒囊膜蛋白(preS)相互作用，从而获得包膜并被释放出细胞外，该过程受Cp第L60、L95、K96和I126等多个氨基酸残基的调控。而位于Cp氨基端的装配结构域和富含精氨酸的羧基端结构域之间的连接区可调控空病毒颗粒的包装和分泌[10]；第五，参与cccDNA池的内补充。与感染过程中进入细胞质中的核衣壳类似，细胞质中复制产生的含有rcDNA的子代成熟核衣壳也可以脱衣壳，将rcDNA转运入细胞核内形成cccDNA，此即为cccDNA的细胞内扩增途径[11]。由于感染来源的成熟病毒核衣壳和细胞内合成的子代成熟核衣壳的脱衣壳过程及位置有所差异，cccDNA的从头合成和细胞内扩增途径受细胞质中核酸酶的差异调控[12]。由此可见，通过核衣壳的包装，脱衣壳以及介导核衣壳与病毒和细胞蛋白的相互作用，Cp参与了病毒DNA复制，cccDNA合成和病毒颗粒的装配等多个环节。

除此之外，也有研究[13]报道未参与衣壳组装的游离Cp二聚体可作为cccDNA微小染色体的成分并调节cccDNA的转录活性。Cp亦被证实可招募干扰素诱导蛋白APOBEC 3A/3B至cccDNA，引起胞嘧啶脱氨化，导致cccDNA降解[14-15]。Cp也可与多种细胞RNA结合蛋白相互作用调节HBV RNA的代谢[16]。综上所述，Cp功能的多样性意味着靶向病毒Cp的抗病毒药物具有抑制病毒复制周期的多个环节以及调控病毒蛋白和核酸代谢的多种潜能。

2HBV Cp变构调节剂的发现及分类

靶向病毒Cp的抗HBV化合物是当前国内外处于研发阶段的热点新药。但核心蛋白变构调节剂(CpAM)的发现则可追溯到20世纪90年代后期。虽然第一个被发现的CpAM为苯丙烯酰胺类化合物(PPA)[17]，但目前处于临床前和临床研发阶段的CpAM主要为杂芳基二氢嘧啶类化合物(HAP)和氨磺酰苯甲酰胺类化合物(SBA)及其第二代和第三代的衍生物[18-19]。根据诱导Cp二聚体装配的产物结构的不同，CpAM可分为两种类型。Ⅰ型CpAM(typeⅠCpAM)主要是HAP衍生物，以Bay41-4109、GLS4等为代表，诱导Cp二聚体错误组装形成多种形态的非衣壳结构聚合物，并最终在细胞内被降解[20-21]。Ⅱ型CpAM (typeⅡ CpAM)主要包括SBA及其衍生物，以DVR23(AB-423)、ABI-H0731、JNJ-56136379和GLP-26等为代表[19, 22]，可诱导Cp二聚体装配产生形态正常但未包装pgRNA和病毒DNA聚合酶的空核衣壳。尽管这两种类型的CpAM诱导产生的Cp二聚体包装产物结构各异，但皆阻断了病毒pgRNA和pol包装入核衣壳及随后的病毒DNA复制。

3HBV Cp变构调节剂的作用靶点及抗病毒机理

Cp在肝细胞中以二聚体的形式作为核衣壳的基本结构单位。研究[23]表明，核衣壳的装配过程由相邻Cp二聚体之间的疏水性相互作用力驱动，首先发生缓慢聚合反应形成六聚体，再以此为基础加速聚合装配形成正20面体核衣壳结构。CpAM结合于相邻Cp二聚体相互作用界面上的疏水性口袋(HAP pocket)以增强Cp二聚体之间的相互作用，加速Cp二聚体的装配过程[24-25]。基于此，该类化合物被命名为CpAM或核衣壳装配调节剂，而非核衣壳装配抑制剂。HAP pocket由25个氨基酸残基形成。因化学结构的差异，不同CpAM与“HAP”口袋中不同的氨基酸侧链结合而干扰核衣壳组装的速率和过程，从而导致装配产物的表型差异。利用Y132A突变的Cp不能装配形成核衣壳，但可形成稳定六聚体并与CpAM形成共结晶的特性，对比研究HAP_R01和SBA_R01与Cp的结合特性发现两者虽皆结合Cp二聚体界面间的“HAP”口袋并与T33结合，但HAP_R01的噻唑基团可结合于其中的一个小口袋(sub-pocket)，并与P25结合。与此结构生物学发现相对应，Cp氨基酸突变分析[26]证明Cp的T33N突变对HAP_R01和SBA_R01均产生耐药，而Cp的P25A或P25S突变只对HAP_R01耐药。借助冷冻电镜分析CpAM与体外装配的空衣壳的相互作用，研究人员发现HAP1和AT-130均结合于HAP口袋并引起核衣壳四级结构的变化，但AT-130也可代偿性地导致核衣壳装配过程中三级结构的变化[24, 27]。显而易见，尽管这些结构生物学和耐药突变分析研究结果可以辅助解释两种类型CpAM的表型和作用机理的差异，但CpAM对核衣壳装配过程的调控机理有待于进一步生物物理学和结构生物学的研究。

除干扰核衣壳的装配之外，CpAM在较高药物浓度下也可以诱导已装配的核衣壳结构改变甚至解聚[28-29]。如前所述，借助冷冻电镜结构分析证实CpAM可结合于已装配的核衣壳中的HAP口袋从而改变衣壳的三级和四级结构。这些结构的改变在一定情况下可以导致核衣壳在琼脂糖凝胶电泳实验中迁移率发生改变[30]。同时，可能是由于双链DNA相对具有刚性并从核衣壳内部产生张力，使得CpAM结合HAP口袋后更易诱导成熟核衣壳解聚的缘故，有研究[31]发现CpAM可选择性地诱导含有双链DNA的成熟核衣壳的解聚。

与CpAM对核衣壳装配和解聚的作用相符，在HBV感染的肝细胞中，CpAM诱导Cp装配产生非衣壳结构聚合物或空衣壳从而干扰HBV DNA复制，最终抑制感染性病毒颗粒的产生。值得注意的是，CpAM因干扰pgRNA-Pol复合体包装入核衣壳内，因此HBV RNA病毒样颗粒的产生也将同时受到抑制，这一现象已在ABI-H0731、GLP-26等临床试验中得到验证(表1)。此外，CpAM在较高浓度(为抑制pgRNA包装浓度的10~34倍)也可以诱导成熟核衣壳的解聚，从而抑制HBV感染及cccDNA的从头合成[30-32]。但与上述现象相反，在一定情况下诱导细胞内产生的子代成熟核衣壳的解聚甚至可促进cccDNA的细胞内扩增。这可能是由于CpAM诱导子代成熟核衣壳的解聚发生于核孔或核孔附近，从而加速了rcDNA向细胞核内的递送和cccDNA的合成增加[31]。笔者最近的研究[33]证实核衣壳蛋白的耐药突变同时抵抗CpAM抑制pgRNA包装、DNA复制和成熟核衣壳解聚及cccDNA从头合成。这些结果进一步证明CpAM的这些抗病毒作用皆通过结合于HAP口袋，并通过与相同的氨基酸残基作用而实现。但截止目前，尚未发现CpAM可以降低HBV感染肝细胞内病毒RNA的水平，表明其并未干扰核心蛋白对cccDNA转录和病毒RNA代谢的调控作用。

4CpAM抑制HBeAg分泌的作用机理

除了抑制病毒复制之外，Ⅰ型和Ⅱ型CpAM在较高药物浓度下(为抑制pgRNA包装/DNA复制浓度的100~500倍)均可降低分泌的HBeAg水平[22, 34]。如图1所示，HBeAg由precore蛋白剪切加工而来。具体来讲，precore蛋白(pre-C，p25)除了共享Cp的全部序列(amino acid，aa 1~183)外，p25在其氨基端还独有一个29个氨基酸残基序列，位于最前端的19个氨基酸残基为其分泌信号肽，可与信号肽识别颗粒结合，引导分子量为25 kD的p25蛋白到达内质网膜。在信号肽酶切割信号肽之后，所产生的p22蛋白被转入内质网腔。当p22蛋白循分泌途径抵达高尔基体内时，furin蛋白酶切割与Cp共享序列的羧基端结构域，最终形成可分泌的p17蛋白。在p17蛋白的(-10)~(-1)区域，(-7)位半胱氨酸(Cystine，C)与第61位半胱氨酸形成分子内C(-7)-C61二硫键，随后进一步形成同源二聚体被分泌至细胞外，即HBeAg。由于分子内二硫键的形成，使得p17二聚体与Cp二聚体结构不同，不能包装产生核衣壳样结构[36]。故与Cp不同，HBeAg以可溶性二聚体形式存在，并被分泌到细胞外。那么，CpAM又是怎样抑制HBeAg分泌的呢？笔者最近的研究[33]发现CpAM并不影响细胞内p22蛋白的水平，但减少细胞内p17。进一步分析发现，并非所有的p17都形成C(-7)-C61分子内二硫键，有40%~50%的p17则以还原形式存在于细胞内。由于还原型p17结构与Cp类似，在环境发生改变时则可能形成Cp样二聚体，并包装形成空衣壳[33, 37]。此外，HAP_R01可诱导还原型p17组装产生非核衣壳样多聚物，某些CpAM耐药突变，如Cp T33N，也抵抗了CpAM对HBeAg分泌的抑制作用[34]。因此，笔者推测CpAM可能结合于还原型p17二聚体间的HAP口袋诱导细胞内还原型p17组装成非核衣壳样多聚物并随之降解，从而抑制HBeAg的分泌。当然，这个理论假说还需进一步的结构生物学和细胞生物化学实验研究的验证。由于抑制HBeAg分泌需要较高浓度的CpAM，目前为止尚未在临床试验中发现其可显著降低血清中HBeAg的水平。由于HBeAg的免疫抑制作用，研发新一代同时有效抑制HBeAg分泌的靶向Cp/p17的抗病毒药物，在抑制病毒复制的同时减少HBeAg的分泌，或可同时改善宿主的抗HBV免疫功能，促进慢性乙型肝炎的功能性治愈。

图1 CpAM在HBV复制周期中的多重抗病毒作用

注：Ⅰ型CpAM诱导Cp二聚体形成多种形态的非衣壳结构，并最终经由自噬途径被降解[35]；Ⅱ型CpAM加速衣壳组装过程，诱导空衣壳结构产生。就结果而言，两种类型的CpAM皆抑制了pgRNA/pol向核衣壳内的包装从而抑制后续HBV DNA的复制；也促进含rcDNA核衣壳的错误解聚从而抑制了cccDNA的从头合成。除此之外，Ⅰ、Ⅱ型CpAM皆直接作用于细胞内的p17从而抑制了HBeAg的分泌。

5CpAM临床试验现状概览

CpAM为目前处于临床前和临床研发阶段的热点新型抗HBV药物，已有超过10种Ⅰ型和Ⅱ型CpAM进入Ⅰ期临床试验，并在概念验证(POC)临床试验中证明其具有明确的抗病毒作用[38](表 1)。进入Ⅱ期临床试验的CpAM存在单一治疗和与其他不同作用机制的新药或与已获批抗HBV药物联合等模式。下面，将简述和讨论几个具有代表性的CpAM临床试验结果。

NVR3-778是第一个进入临床试验的CpAM。在28 d的POC临床试验中，该药单独或与PEG-IFNα-2a联用均显著降低CHB患者血清HBV DNA和HBV RNA水平。且联合用药抑制病毒复制强度优于单一用药[39]。GLS4是Ⅰ型CpAM的代表性药物，不仅高效干扰核衣壳装配和解聚，也对核苷类药物耐药的HBV有相同的抗病毒活性。该化合物在健康受试者体内单独使用时尽管安全性和耐受性良好，但单用无法维持有效的血药浓度。目前GLS4多与利托他韦联用以提高GLS4的血药浓度[40]。在为期28 d的POC临床试验中，GLS4与利托他韦联用组患者耐受性良好且血清HBV DNA、HBV RNA下降明显，同时HBsAg和HBcAg也呈一定幅度的下降。Ⅱ型CpAM AB-506可广泛抑制A~H基因型HBV的复制，并抑制核苷(酸)类似物(NUC)耐药突变的HBV复制。在HBV高压水动力小鼠动物实验中可使小鼠血清中HBV DNA下降3log10，在与RNAi和NUC联用时表现出协同作用[41]。在为期28 d的Ⅰ期临床POC试验中，AB-506对血清HBV DNA、HBV RNA的抑制最高可达-2.8 log10拷贝/mL，与同期其他CpAM抗病毒水平相当[42]。但由于试验中观察到健康受试者人群中发生2例急性肝炎，处于安全性考虑该药的后续临床试验已终止。值得一提的是，1例在治疗基线发生Cp I105T自然突变的CHB患者对160 mg/d剂量的AB-506呈现无应答状态。体外细胞抗病毒试验进一步证实Cp I105T突变HBV对AB506耐药[43]。此为迄今为止唯一报道的CpAM原发耐药的病例。可以预见，随着CpAM临床研究的广泛深入，更多的原发和继发抗药突变将被发现。这也为今后CpAM耐药突变机理的研究，耐药病毒的监测验证和开发新型具有高耐药屏障的CpAM提出了更高的要求。

Ⅱ型CpAM ABI-H0731为近期临床试验推进最快的CpAM之一。其安全性、有效性皆在Ⅰ期临床试验中得到了积极反馈，对CHB患者血清中HBV DNA、HBV pgRNA呈现出很好的抑制效应[44]。在NUC经治的、已获得持续病毒学抑制的HBeAg阳性或阴性CHB患者中，ABI-H0731联用NUC可帮助NUC经治的HBeAg阳性患者血清HBV DNA实现更快地下降、实现pgRNA阴转，但HBsAg的变化不明显[45]。在后续临床试验中发现，无论在NUC初治人群或经治人群，尽管相比于单独使用恩替卡韦，联合使用ABI-H0371与恩替卡韦呈现出更快更显著的HBV DNA、HBV pgRNA的降低，ALT复常率明显升高[46]。但在HBeAg阳性的NUC未治CHB人群，ABI-0731与NUC联用72周时仍无法实现持续性病毒学应答(血清HBV DNA、HBV RNA水平虽持续下降，但仍未低于检测下限)；在HBeAg阳性或阴性的NUC经治患者组，部分患者血清HBV DNA、HBV RNA水平低于检测下限且HBeAg水平阴转或≤5 IU/mL时停止治疗观察其病毒学反弹情况，结果显示所有停止治疗的患者在16周内全部病毒学反弹[47]。这些临床试验数据表明，现有CpAM可显著降低CHB患者血清中的HBV DNA和HBV RNA，但并未显著影响患者血清中病毒抗原的水平。且多数CpAM在Ⅱ期临床试验中选择与现有抗HBV药物联合用药，以监测其是否具有抑制HBV复制的协同作用，但与上述ABI-H0731的Ⅱ期临床试验结果类似，CpAM与其他药物联用时确实具有更好的协同抗病毒作用，但停药后全部观察到病毒学反弹。

6CpAM对促进CHB患者功能性治愈的临床应用前景

CpAM因其作用于HBV复制和抗原分泌等多个重要环节，是一类备受期待的新型抗HBV药物。然而，目前的临床试验结果表明，尽管其具有较强的抗病毒活性，能显著降低患者血清中HBV DNA和RNA，但不显著改变病毒蛋白水平(表 1)。尽管CpAM与NUC联用可更快更强降低HBV DNA和RNA，但对患者的血清HBsAg水平并无显著影响，且停止给药后仍有高的病毒学反弹，无法获得长时间的病毒学抑制。这些研究结果表明，在绝大多数患者有限疗程(1年，甚至3年)的强效抑制HBV DNA复制并不能耗竭或持续沉默cccDNA、或有效激活宿主抗病毒免疫反应，因而无法达到持久控制HBV感染的目的。此外，越来越多的证据表明在病毒复制被抑制后，有效激活宿主特异性抗病毒体液和细胞免疫为CHB功能性治愈所必需。因此，亟需研发可高效抑制cccDNA合成和HBeAg分泌的新型CpAM，并与其他类型抗病毒药物(siRNA)和免疫治疗药物(PEG-IFNα-2a, TLR7 or TLR8激动剂，治疗性疫苗等)联合或序贯治疗，以期加速cccDNA耗竭、降低病毒抗原水平并激活HBV特异性抗病毒免疫，从而控制HBV感染，实现CHB的功能性治愈。

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http://www.lcgdbzz.org/cn/article/doi/10.3969/j.issn.1001-5256.2022.08.005

引证本文

刘慧, 鲁凤民, 郭巨涛. 乙型肝炎病毒核心蛋白变构调节剂的作用机理及临床研发和应用前景[J]. 临床肝胆病杂志, 2022, 38(8): 1726-1732.

本文编辑：王莹

公众号编辑：邢翔宇